PCR儀主要適用于醫(yī)學(xué)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、分子生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因檢測(cè)等領(lǐng)域。PCR儀可分為梯度PCR儀、原位PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、普通PCR儀。下面將為您詳細(xì)介紹PCR儀：

一、PCR儀分類(lèi)

1.梯度PCR儀：是由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴(kuò)增儀。PCR反應(yīng)能否成功，退火溫度是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個(gè)孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出[much]適反應(yīng)條件。

2.原位PCR儀：可用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀，可保持細(xì)胞組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：它的的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的PCR核酸檢測(cè)、分子診斷的技術(shù)飛躍。是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。

4.普通PCR儀：可應(yīng)用于科研研究，教學(xué)，醫(yī)學(xué)臨床，檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu)，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。

二、PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例

1.研究：基因克隆;DNA測(cè)序;分析突變;基因重組與融合;鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的繪圖;檢測(cè)基因的修飾;合成基因的構(gòu)建;構(gòu)建克隆 或表達(dá)載體;檢測(cè)某基因的內(nèi)切酶多態(tài)性。

2.免疫學(xué)：HLA分裂;T細(xì)胞受體或抗體多樣化的定性;自身免疫病基因作圖;淋巴因子定量

人類(lèi)基因組工程：用散布重復(fù)序列產(chǎn)生DNA標(biāo)志;遺傳圖譜的構(gòu)建(檢測(cè)DNA、 多態(tài)性或精子繪圖);物理圖譜的構(gòu)建;測(cè)序，表達(dá)圖譜。

3.診斷：細(xì)菌(螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、立克次氏體、白喉?xiàng)U菌、致病大腸桿菌、痢疾桿菌、嗜水氣單胞菌和艱難梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細(xì)小病毒B19);寄生蟲(chóng)(瘧疾 等);人遺傳病(Lesh-Nyhan綜合癥、地貧、血友病、BMD、DMD、囊性纖維化等)。

 

4.法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析;HLA-DQ。

5.腫瘤：胰癌、結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤。

6.組織和群體生物學(xué)：遺傳聚類(lèi)研究;動(dòng)物保護(hù)研究;生態(tài)學(xué);環(huán)境科學(xué);實(shí)驗(yàn)遺 傳學(xué)古生物學(xué)：考古與博物館標(biāo)本分析。

7.動(dòng)物學(xué)：動(dòng)物傳染病的診斷等

8.植物學(xué)：檢測(cè)植物病原等

三、PCR儀使用說(shuō)明：

（一）試劑PCR儀

1.引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。

2.耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫90℃-100℃。

3.10×PCR緩沖液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購(gòu)買(mǎi)。

4.5mmol/L dNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度理想地用UV吸收法[accurate測(cè)定?，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。

5.DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA。

（二）操作程序PCR儀

過(guò)去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：

1.向一微量離心管中依次加入

DNA模板             102-105拷貝

引物                各1μmol/L

dNTP                各200μmol/L

10×PCR緩沖液       1/10體積

ddH2O               補(bǔ)到終體積（終體積50μl-100μl）

混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。

2.加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。

3.冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。

4.PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?/span>94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。[much]后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。

PCR儀尚可用于組織標(biāo)本DNA的擴(kuò)增。由于固定組織標(biāo)本的DNA常發(fā)生降解，就給常用的分析方法如Southern轉(zhuǎn)印雜交等帶來(lái)一定困難。

在應(yīng)用PCR方法檢測(cè)RNA病毒時(shí)，首先應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)?/span>PCR只能對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，我們把這種RNA的PCR反應(yīng)稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR。把由RNA轉(zhuǎn)化成DNA的過(guò)程叫做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄需要在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成。

四、PCR儀詳細(xì)操作步驟：

1、開(kāi)機(jī)：打開(kāi)開(kāi)關(guān)，視窗上顯示“SELF TEST”，顯示10秒中后，顯示RUN-ENTER菜單： “-RUNENTER PROGRAM  PROGRAM ”準(zhǔn)備執(zhí)行程序。

2、放入樣本管，關(guān)緊蓋子。

3、如果要運(yùn)行已經(jīng)編好的程序，則直接按《Proceed》，用箭頭鍵選擇已儲(chǔ)存的程序，按《Proceed》，則屏幕顯示：“- ENABLE      DISABLE  HEATED LID” 按《Proceed》選擇ENABLE，則開(kāi)始執(zhí)行程序。

4、如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕顯示  “  -NEWLIST EDITDELET”，按《Proceed》

1）選擇NEW，命名新的程序，[much]多8個(gè)字母，輸入后按《Proceed》確認(rèn)。

2）輸入程序步驟：名字輸入后，顯示“  STEP1  _TEMP GOTO   OPITON  END”，按《Proceed》則可以輸入溫度（0～100℃），按《Proceed》確認(rèn)后，則可以輸入孵育時(shí)間，用《Select》鍵移動(dòng)光標(biāo)，輸入數(shù)字，完成后按《Proceed》確認(rèn)，跳到下一步，輸入方式同上。

3）選擇GOTO，輸入循環(huán)步驟時(shí)鏈接到第幾步（循環(huán)數(shù)[much]多可達(dá)9999次）（為實(shí)際循環(huán)數(shù)-1)。

4) 選擇option，顯示“ STEP EXTENDI NCREMENT  SLOPE ”再選擇increment，按《Proceed》確認(rèn)，輸入初始的溫度，確認(rèn)后輸入時(shí)間，按《Proceed》確認(rèn)，然后輸入每個(gè)循環(huán)增加或減少的溫度，增加用正值，減少用負(fù)值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》確認(rèn)。選擇extend，按《Proceed》確認(rèn)，輸入每個(gè)循環(huán)增加或減少的時(shí)間（-60～60秒），按《Proceed》確認(rèn)。

選擇slop（指溫度上升或下降的速率），輸入溫度的改變值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》確認(rèn)，然后輸入加熱或致冷的速度，按《Proceed》確認(rèn)。

4）選擇End，輸入結(jié)束步驟。

5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開(kāi)始運(yùn)行。

6、其它：用《pause》可以暫停一個(gè)運(yùn)行的程序，再按一次繼續(xù)程序。用《stop》或《Cancel》可停止運(yùn)行的程序。

五、PCR儀使用注意事項(xiàng)：

1. PCR儀應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的平臺(tái)上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。

2.環(huán)境溫度保持在23℃左右，濕度保持在60％左右。

3.應(yīng)配備功率≥3000W的穩(wěn)壓器。

4.應(yīng)定期清潔維護(hù)。

5.使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守上述使用步驟。

六、PCR儀維護(hù)保養(yǎng)方法：

1.樣品槽應(yīng)每月定期進(jìn)行清理（在樣品槽中加入少量95％乙醇，用棉簽擦洗反應(yīng)孔，用干棉簽吸干乙醇）。

2.每月應(yīng)定期對(duì)熱蓋進(jìn)行清潔。

3.校正ROI光路以便確信結(jié)果仍然是優(yōu)化的。

4.每月檢查樣品槽的熒光污染，如有需要隨時(shí)進(jìn)行。

七、PCR儀常見(jiàn)故障處理方法：

1.使用PCR管，反應(yīng)后部分PCR管內(nèi)反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)

解決方法：a.確保使用高質(zhì)量的PCR管或使用我們推薦的PCR管

b.在樣品臺(tái)的四角放置四個(gè)同樣的空PCR管，以保證熱蓋壓在各PCR管上的壓力均勻

2. 使用的微孔板，反應(yīng)后反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)

a.確保使用高質(zhì)量的微孔板，反應(yīng)前要嚴(yán)格密封

b.確保蓋緊熱蓋，適當(dāng)提高熱蓋的溫度

c.增大反應(yīng)體積

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